急性有机磷酸酯类杀虫剂中毒事件卫生应急处置技术方案

附件4：酶抑制率法（分光光度法）定量检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量

附件4

酶抑制率法（分光光度法）定量检测蔬菜中

有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量

参照（GB/T 5009.199─2003）

1 适用范围

本方法准适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速定量测定。该方法定值是以抑制率的形式出现，可用其它分析方法进一步确定具体农药品种和含量。

2 原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

3 试剂 

3.1 pH8.0缓冲溶液

分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000ml蒸馏水溶解。 

3.2 显色剂

分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20ml缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

3.3 底物

取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0ml蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。 

3.4 乙酰胆碱酯酶

根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化ΔA0值应控制在0.3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过四天。 

可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的ΔA0值应控制在0.3以上。

4 仪器 

4.1 分光光度计或相应测定仪。 

4.2 常量天平。 

4.3 恒温水浴或恒温箱。 

5 分析步骤 

5.1样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5ml缓冲溶液，振荡1min～2min，倒出提取液，静置3min～5min，待用。

5.2对照溶液测试：先于试管中加入2.5ml缓冲溶液，再加入0.lml酶液、0.1ml显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.lml底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值ΔA0。

5.3样品溶液测试：先于试管中加入2.5ml样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值ΔAt。

6 结果的表述计算 

6.1结果计算见式（1）。

抑制率(%)=[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100…………………………（1） 

式中：ΔA0——对照溶液反应3min吸光度的变化值； 

ΔAt——样品溶液反应3min吸光度的变化值。 

6.2 结果判定

结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。 当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。对阳性结果的样品，可用其它方法进一步确定具体农药品种和含量。

7 附则 

7.1 酶抑制率法技术指标 

7.1.1灵敏度指标：酶抑制率法对部分农药的检出限见下表。

酶抑制率法对部分农药的检出限

7.1.2符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。 

8 说明 

8.1 葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

8.2 当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化ΔA0值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3min的吸光度变化ΔA0值＜0.3 的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。

8.3 考虑到酶试剂的有效期很短，最好在实验前，测试酶的活性，达到要求后才能往下进行。

8.4 也可使用符合上述方法要求的快速检测仪。